癌基因RMP在肝癌上皮间质转化中的作用及其与肿瘤侵袭转移的关系

【摘要】目的：通过研究RMP过表达和RMP干扰表达的HepG2细胞株的细胞形态、粘附能力和迁移侵袭能力的改变，探究RMP对肝癌细胞EMT的影响。方法：本实验室保存的RMP过表达质粒pCDNA3.1-RMP和RMP干扰质粒pGPU6-RMPi经双酶切鉴定无误后进行脂质体转染；确定肝癌HepG2细胞的G418药物筛选浓度；转染各组质粒后的HepG2细胞经G418筛选得到RMP过表达细胞株和RMP干扰表达细胞株；各细胞株分别通过RT-PCR，qRT-PCR，CCK-8实验鉴定所得细胞株中外源质粒的整合情况，检测RMPmRNA的表达水平和细胞增殖水平；倒置显微镜观察稳定转染细胞株的细胞形态；粘附实验检测RMP对肝癌细胞异质粘附能力的影响；划痕实验，Transwell侵袭迁移实验检测RMP过表达和干扰表达对肝癌细胞迁移和侵袭能力的改变；Transwell侵袭迁移实验探讨瞬时转染不同剂量pCDNA3.1-RMP质粒对肝癌细胞侵袭迁移能力的影响；RT-PCR和明胶酶谱实验分别检测各组细胞的MMPs表达量和酶活性；WesternBlot检测各细胞株中E-cadherin、N-cadherin及Vimentin等EMT相关通路蛋白的表达水平。结果：1.经质粒双酶切鉴定，成功检测到RMP过表达质粒：pCDNA3.1-RMP中1619bp的重组RMP条带；RMP干扰质粒：pGPU6-RMPi中53bp的发卡条带。2.HepG2细胞于含不同浓度G418的培养基中培养14天后，得出600ng/μl为最佳G418药物筛选浓度。3.HepG2细胞转染各组质粒24h后，加入G418筛选14天，经单克隆挑取和单克隆扩大培养并鉴定，得到目标细胞株。4.倒置显微镜观察各组细胞形态，发现RMP过表达的HepG2细胞株细胞形态变为纺锤型，细胞与细胞间粘附消失。5.软琼脂克隆实验证明，RMP过表达能够促进肝癌细胞的锚定非依赖生长能力(p＜0.01)，干扰RMP表达后肝癌细胞锚定非依赖生长能力降低(p＜0.05)。进一步分析结果发现，RMP过表达的HepG2细胞株形成的肿瘤微球形态松散，丧失细胞间粘附。而干扰RMP表达的HepG2细胞株所形成的肿瘤微球形态紧实，胞间粘附完整。6.粘附实验结果证明，RMP过表达能够降低肝癌细胞的异质粘附能力(p＜0.001)，干扰RMP表达则不影响肝癌细胞的粘附能力。7.划痕实验和Transwell实验证明了RMP过表达能促进肝癌细胞的迁移能力和侵袭能力(p＜0.001)，并且随RMP表达量的升高，细胞侵袭迁移能力也显著升高(p＜0.001)。8.RT-PCR检测发现RMP过表达能够提高肝癌细胞中MMP-2，MMP-9的表达水平(p＜0.001)，干扰RMP则降低细胞中MMP-2，MMP-9的表达水平(p＜0.001)。9.明胶酶谱实验则证明了RMP对细胞活性MMP-2的分泌是至关重要的(p＜0.001)。10.Westernblot实验发现，RMP在肝癌细胞中过表达能够抑制上皮细胞标志物E-cadherin的表达(p＜0.001)，并促进间质细胞标志物N-cadherin和Vimentin的表达(p＜0.001)，干扰RMP表达则不影响上述三种蛋白的表达量。结论：1.RMP可以促进肝癌细胞的体外迁移，并且能够通过促进MMPs的表达，增强肝癌细胞的侵袭能力。干扰RMP表达则能够抑制这一现象。2.RMP能够影响肝癌细胞的细胞形态和3D培养中的集落形态，并上调间质细胞标志物N-cadherin，Vimentin，抑制上皮粘附分子E-cadherin，说明RMP过表达可以促进肝癌细胞EMT的发生，但干扰肝癌细胞中的RMP的表达却不影响细胞表型。
【作者】周围；
【导师】魏文祥；
【作者基本信息】苏州大学，细胞生物学，2014，硕士
【关键词】RMP；EMT；侵袭；迁移；

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